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Etude des relations Structure-Fonction chez les Laccases.

Personnes impliquées: T. Tron, C. Gaudin, G. Iacazio  


* Laccases

Les laccases sont des enzymes à cuivre qui oxydent les polyphénols en utilisant l'oxygène comme accepteur final d'electrons.  Elles sont présentes dans les plantes, dans de très nombreux champignons (dégradation de la lignine) ainsi que dans quelques bactéries.

* Structures connues de Laccases:

Leur site actif est constitué de 4 atomes de cuivre, un de type 1, isolé, responsable de l'oxydation des phénols et un cluster de 3 atomes de cuivre (1 de type 2 et 2 de type 3) responsable de l'activation du dioxygène.

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Schéma montrant l'environnement des 4 cuivres dans le site actif des laccases

* Mécanisme d'action:

Le mécanisme d'action des laccases et notamment le rôle du centre métallique, reste mal connu. Il est admis un mécanisme en deux temps :

  1. le cuivre T1 arrache un électron au substrat
  2. l'électron est transféré au centre T2/T3 sur une distance d'environ 12,5 Å . Après complète réduction du centre trinucléaire, la réduction de l'oxygène moléculaire intervient.

 

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Schéma général de la réaction d'oxydation des phénols par les laccases

* Etude moléculaire des laccases issues du basidiomycète C30:

La littérature sur la dégradation biologique de la lignine et sa biosynthèse met en évidence l'intervention de laccases et de peroxydases dont les rôles respectifs exacts dans l'oxydation des structures moléculaires de la lignine sont loin d'être complètement éclaircis.
Notre travail porte principalement sur la caractérisation des laccases du basidiomycète C30.
Ce champignon a été prélevé sur une litière de chênes verts dans le var et ses principales caractéristiques métaboliques et potentialités enzymatiques ont été décrites (Tagger et al, 1998, [1]).
La séparation et la purification des laccases sécrétées par la souche C30 dans le milieu de culture (Dédeyan, 1996, [2]) ont montré la présence d'au moins 3 enzymes. La laccase 1 étant largement majoritaire bien que présentant une activité spécifique nettement plus faible que celle des deux autres laccases a été caractérisée plus en détails (pH optimum, pI, séquençage de l’extrémité N-terminale et composition de la fraction glycosylée). Les techniques spectroscopiques (absorption atomique, RPE), ont montré que cette enzyme possède 4 atomes de cuivre dont l’arrangement correspond aux enzymes classées dans la famille des oxydases bleues à cuivre (Dédeyan et al, 2000, [3]).

Plus récemment, grâce à des modifications des conditions de culture (influence de la teneur en cuivre, nature des inducteurs), il a été observé une complexité plus grande (5 ou 6 isoenzymes au lieu de 3) relative à la production de laccases par la souche C30 (Klonowska et al, 2001 [4]). La caractérisation des laccases se fait donc au fur et à mesure de leur révélation, le but étant de déterminer les mécanismes de régulation de leur synthèse, d’établir une liste de leurs substrats naturels et des inducteurs de cette synthèse. Ainsi, une laccase 2 a été caractérisée récemment et ses propriétés comparées à celles de la laccase 1 (Klonowska et al, 2002 [5]).
Une récente étude au niveau moléculaire des ADN ribosomaux de ce champignon, qui avait été au départ improprement considéré comme une souche de Marasmius quercophilus,  a montré qu'il s'agissait en fait d'une souche de Trametes (Klonowska et al, 2003 [6])
Si l'intérêt des laccases n'est plus à démontrer, une des limitations à leur utilisation massive est très probablement liée aux difficultés de manipulation des organismes qui les produisent. La sélection des champignons, leur culture et la production de polyphénoloxydases sont des étapes souvent longues et aléatoires. Nous avons donc envisagé:

  1. De cloner les gènes codant pour les laccases issues de Trametes C30 et de les exprimer dans un hôte hétérologue.
  2. D'utiliser ce système pour produire et étudier des enzymes modifiées afin de mettre au point des outils plus performants dans le domaine d'action des laccases.
Les gènes codant pour les différentes laccases de Trametes C30 ont été (ou seront) progressivement séquencés (Thèse de A. Klonowska, Décembre 2000, [7]), puis clonés chez Saccharomyces cerevisiae ce qui doit permettre d’obtenir des quantités plus importantes des enzymes peu abondantes dans les milieux de culture. Cette voie de recherche a pour but l’étude des relations structure-fonction qui pourrait expliquer les différences observées entre ces enzymes au niveau de leurs paramètres cinétiques ainsi que de préciser le rôle de chacune de ces isoformes dans la dégradation des composés polyphénoliques tels que la lignine ou les tanins.

Un premier résultat dans cette voie a été l'obtention et la caractérisation d'un nouvel enzyme, par expression dans Saccharomyces cerevisiae, la laccase 3, qui n'était pas présent (ou indécelable) dans le milieu de culture du champignon (Klonowska et al, 2005 [8]).

Références:

[1] S. Tagger, C. Perissol, G. Gil, G. Vogt, J. Le Petit, 1998. Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.) Enzyme Microbiol. Technol. 23, 372-379.

[2] B. Dédeyan, 1996. Purification et caractérisation des laccases de Marasmius quercophilus. Thèse de l'Université d'Aix-Marseille III.

[3] B. Dédeyan, A. Klonowska, S. Tagger, T. Tron, G. Iacazio, G. Gil, J. Le Petit, 2000. Biochemical and molecular characterization of a laccase from Marasmius quercophilus. Appl. Environ. Microbiol., 66, 925-929.

[4] A. Klonowska, J. Le Petit, T. Tron, 2001. Enhancement of minor laccases production in the basidiomycete Marasmius quercophilus C30. FEMS Microbiol Lett. 200, 25-30.

[5] A. Klonowska, C. Gaudin, A. Fournel, M. Asso, J. Le Petit, M. Giorgi, T. Tron, 2002. Characterization of low redox potential laccase from Basidiomycete C30. European Journal of Biochemistry. 269, 6119-6125.

[6] A. Klonowska, C. Gaudin, M. Ruzzi, M. C. Colao, T. Tron, 2003. Ribosomal DNA sequences analysis show that the basidiomycete C30 belongs to the genus Trametes. Research in Microbiology. 154, 25-28.

[7] A. Klonowska, 2000. Expression hétérologue de laccases du champignon Marasmius quercophilus chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Thèse de l'Université d'Aix-Marseille III.

[8] A. Klonowska, C. Gaudin, M. Asso, A. Fournel, M. Reglier, T. Tron, 2005. Lac3, a new low redox potential laccase from Trametes C30 obtained as a recombinant protein in yeast. Enzyme and Microbial Technology. 36, 24-41

* Projets:

Une étude de l'influence de mutations au niveau de l'environnement du site actif est programmée pour identifier les résidus responsables des variations observées d'activités spécifiques, d'affinités et de potentiels redox chez les differentes laccases étudiées.


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